วัดมหาธาตุ (Wat Mahathat) ถือเป็นพระอารามหลวงที่สำคัญที่สุดแห่งหนึ่งของจังหวัดยโสธร และเป็นศูนย์กลางทางพระพุทธศาสนา วัฒนธรรม และประวัติศาสตร์ของเมืองมาตั้งแต่อดีต เดิมพื้นที่บริเวณนี้คือ “บ้านสิงห์ท่า” ชุมชนเก่าแก่ริมลำน้ำทวนที่พัฒนาขึ้นเป็นเมืองยโสธรในเวลาต่อมา วัดจึงเปรียบเสมือนหัวใจของชุมชนและเป็นสถานที่ประกอบพิธีสำคัญของเมืองมาอย่างยาวนานจุดสำคัญที่สุดของวัดคือ “พระธาตุอานนท์” พระธาตุศักดิ์สิทธิ์ที่ชาวยโสธรเคารพนับถืออย่างสูง ตามตำนานกล่าวว่า ภายในบรรจุพระอัฐิธาตุของพระอานนท์ พระอุปัฏฐากผู้ใกล้ชิดพระพุทธเจ้ามากที่สุด และเป็นผู้มีบทบาทสำคัญในการสังคายนาพระธรรมวินัยครั้งแรกหลังพุทธปรินิพพาน พระธาตุแห่งนี้จึงมีความหมายทั้งในเชิงประวัติศาสตร์และจิตใจของชาวพุทธในภาคอีสานลักษณะสถาปัตยกรรมของพระธาตุโดดเด่นไม่เหมือนพระธาตุทั่วไปในไทย ฐานเป็นรูปสี่เหลี่ยมจัตุรัสแบบศิลปะล้านช้าง ผสมผสานศิลปกรรมพื้นถิ่นอีสาน มีความสูงประมาณ 25 เมตร ส่วนยอดเป็นทรงบัวเหลี่ยมซ้อนชั้นอย่างงดงาม แสดงอิทธิพลศิลปะลาวโบราณที่ได้รับความนิยมในลุ่มน้ำโขงช่วงอดีต รอบองค์พระธาตุมีลวดลายปูนปั้นและซุ้มจระนำที่สะท้อนฝีมือช่างพื้นบ้านดั้งเดิมได้อย่างละเอียดอ่อน
ภายในพระอุโบสถประดิษฐาน “พระพุทธบุษยรัตน์” หรือที่ชาวบ้านเรียกว่า “พระแก้วขาว” พระพุทธรูปศักดิ์สิทธิ์คู่บ้านคู่เมืองของจังหวัดยโสธร มีพุทธลักษณะงดงามอ่อนช้อยตามแบบศิลปะล้านช้าง พระพักตร์สงบนุ่มนวล พระวรกายได้สัดส่วน เชื่อกันว่าหากผู้ใดได้มากราบไหว้ด้วยจิตศรัทธาจะได้รับความเป็นสิริมงคล ปัจจุบันพระแก้วขาวยังเป็นศูนย์รวมจิตใจของประชาชนในช่วงงานบุญสำคัญต่าง ๆ ของจังหวัดอีกด้วยอีกหนึ่งจุดที่ทรงคุณค่าทางวัฒนธรรมคือ “หอไตรกลางน้ำ” อาคารไม้โบราณที่สร้างแยกออกจากพื้นดิน เพื่อป้องกันปลวกและแมลงทำลายคัมภีร์ใบลาน ภายในเคยใช้เก็บพระไตรปิฎก เอกสารโบราณ และตำราพื้นบ้านอีสาน ตัวอาคารมีงานแกะสลักไม้ลวดลายไทย–ลาวที่ประณีต โดยเฉพาะลายเครือเถา นาค และลายพรรณพฤกษาที่สะท้อนภูมิปัญญาช่างท้องถิ่นในอดีตได้อย่างชัดเจน
บรรยากาศภายในวัดมีความสงบ ร่มรื่น และยังคงกลิ่นอายเมืองเก่าเอาไว้ได้ดี นักท่องเที่ยวสามารถเดินชมพระธาตุ หอไตร และอาคารโบราณต่าง ๆ ได้อย่างเพลิดเพลิน โดยเฉพาะช่วงเช้าหรือช่วงเย็นที่แสงแดดอ่อนจะช่วยขับให้สีทองขององค์พระธาตุและรายละเอียดสถาปัตยกรรมดูโดดเด่นสวยงามมากยิ่งขึ้น นอกจากนี้ วัดมหาธาตุยังเป็นหนึ่งในสถานที่สำคัญของงานประเพณีบุญบั้งไฟยโสธร ซึ่งสะท้อนวิถีชีวิตและวัฒนธรรมอีสานได้อย่างมีชีวิตชีวาอีกด้วย